Truyện có nội dung đặt trong hư cấu lịch sử của thế giới thực, với các chuỗi sự kiện diễn ra trong ba giai đoạn, và có sự xuất hiện của ba nhân vật chính: Altaïr ibn-La'Ahad vào thế kỉ 13 ở Masyaf, Ezio Auditore da Firenze vào thế kỉ 16 tại Constantinopolis, và nhân vật chính của cả truyện: Desmond Miles vào thế kỉ 21. Cốt truyện là chuyến du hành và thám hiểm của Ezio nhằm vén màn bí mật ở Hầm mộ của Altaïr bằng các chìa khóa có dạng hình dĩa. Những chiếc chìa khóa này chứa đựng kí ức của Altaïr và được giấu ở thành phố Constantinopolis, Đế quốc Ottoman. Xen kẽ những sự kiện trong lịch sử là những hoạt động của Desmond trong hiện tại, nhằm đối phó với kẻ thù của Assassin, Hiệp sĩ dòng đền, và ngăn chặn hiện tượng 2012 xảy ra....